GENÉTICA - ESTUDO DE CASO

Caracterização da variabilidade genética em populações da serpente Bothrops moojeni

INTRODUÇÃO

A industrialização, urbanização, crescimento da área de plantio de monoculturas tem acelerado o processo de extinção de várias espécies do Cerrado. Esses fenômenos têm levado à pronunciadas alterações e empobrecimento da paisagem do Cerrado nas últimas décadas.

A Caiçaca (Bothrops moojeni) é uma espécie de serpente que sofre com alteração e fragmentação de habitat, assim como outros dos componentes da Herpetofauna do Cerrado. Tendo em vista os crescentes problemas ambientais que incidem sobre o Cerrado, estudos voltados para a identificação da variabilidade genética de populações. A estrutura genética de uma população se refere ao grau de endogamia dentro e entre as populações e à eterogeneidade na distribuição dos genótipos. Já o status genético se refere às tendências em abundância e distribuição ao longo do tempo, como por exemplo, identificação na população da ocorrência de gargalos, depressão por endogamia, perda da variabilidade genética. Do mesmo modo em que auxiliam o manejo das populações, estudos sobre o grau de variação genética presente em populações naturais nos permitem compreender mais a fundo os processos evolutivos em nível intra-específico, pois tornam possível a identificação das variações que podem estar ocorrendo dentro de uma espécie.

A análise de populações usando técnicas de genética molecular é necessária para se conhecer relações genéticas entre indivíduos de locais conhecidos.

OBJETIVO

Este trabalho teve como objetivo geral realizar a caracterização genética de populações de Bothrops moojeni (Caiçaca) com o intuito de subsidiar o estabelecimento de estratégias de manejo e conservação desta espécie de viperídeo que apresenta amplo interesse na área da saúde.

GENÉTICA DE POPULAÇÕES E CONSERVAÇÃO DA BIODIVERSIDADE

A genética de populações se propõe a descrever a maneira pela qual a freqüênciade alelos muda ao longo do tempo. A Genética da conservação é a aplicação das teorias da genética para a preservação das espécies. Atualmente, já existem provas tanto teóricas como experimentais que sustentam a íntima ligação entre mudanças genéticas em pequenas populações e sua possível extinção. Um exemplo disso é a observação de que a perda de diversidade genética aumenta a suscetibilidade das populações à extinção. Uma maneira de expressar a variabilidade é analisar dados genéticos e expressar os dados em termos de freqüências gênicas (ou alélicas).

A distribuição de genótipos é expressa pela equação p2 + 2pq + q2 = 1, que representa o desdobramento do seguinte binômio (p + q)² onde, p representa freqüência do alelo dominante e q representa a freqüência do alelo recessivo. Portanto, p2 representa a freqüência do genótipo homozigoto dominante, 2pq representa a freqüência do genótipo heterozigoto e q2 representa a freqüência do genótipo homozigoto recessivo. Este teorema, então, só é válido para populações que sejam infinitamente grandes, com cruzamentos ao acaso, isentas de fatores evolutivos, tais como, mutação, seleção natural e fluxo gênico. Quando encontramos uma população que está de acordo com essas premissas, dizemos que ela se encontra em equilíbrio genético. Dentre os fatores evolutivos podemos considerar as mutações, onde diferentes locos podem surgir por mutações ao acaso, um gene mutante que determine maior viabilidade dos indivíduos vai aumentar a sua freqüência no conjunto gênico da população;

1) Seção natural: nas populações os diferentes genótipos não têm a mesma viabilidade, a liminação ou redução dos genótipos menos viáveis provoca alteração nas freqüências gênicas de uma geração à outra;

2) Fuxo gênico: movimentos migratórios introduzem ou retiram alelos das populações, provocando mudanças nas freqüências gênicas e genotípicas e

3) Driva genética: a estabilidade das freqüências gênicas varia conforme o tamanho das populações.

Os marcadores genéticos se tornam ferramentas úteis na identificação de populações nas quais se espera que questões genéticas afetem suas expectativas de sobrevivência continuada e permitem estudos a respeito da estrutura genética de indivíduos e populações para sua caracterização e preservação de recursos genéticos. Assim, é possível perceber como a Genética Molecular tem trazido grandes contribuições para a genética de populações, bem como para a genética da conservação. Pois, através da genética molecular obtêm-se informações importantes sobre espécies ameaçadas, tais como, tamanho efetivo populacional, fluxo gênico e gargalos populacionais.

MATERIAIS E MÉTODOS

Foram obtidas amostras de sangue de 75 indivíduos coletados em cinco locais de ocorrência da espécie nos Estados de Mato Grosso do Sul (Sonora), Mato Grosso (Canabrava) e Goiás (Goiânia, Jataí e Minaçu) de acordo com a disponibilidade de exemplares no Núcleo de Ofiologia da Universidade Católica de Goiás (NUROG). O sangue era então colocado em um tubo vacutainer contendo anticoagulante EDTA e transportado até o Laboratório de Genética e Melhoramento do Departamento de Zootecnia/ITS/UCG, onde eram conservadas a 4ºC até ao momento da extração para evitar a coagulação do sangue e a degradação do DNA. Então se começava a extração do DNA que era realizado no mesmo dia da coleta do sangue dos animas.

O DNA extraído do sangue seguindo de um protocolo do kit de purificação de DNA de sangue, fornecido pela Amersham Pharmacia BiotechTM . Em seguida foi realizado um teste amplificação utilizando 9 primers das séries OPA (1, 2 e 3), OPB (1, 2 e 3), OPC (1, 2 e 3) para verificar a qualidade do DNA extraído. A seleção dos primers RAPD foi, então, feita utilizando amostras de três indivíduos para a amplificação, via Reação em Cadeia da Polimerase, de 78 primers das séries OPA (1 a 16), OPB (1 a 20), OPM (1 a 20) e OPP (1 a 20) da marca Operon. Cada gel da seleção de primers foi codificado considerando presença (1) ou ausência (0) da banda nas amostras e sua intensidade. As bandas eram classificadas quanto à intensidade, sendo elas, fraca (1), média (2) e forte (3). Em seguida foi feita uma média de intensidade por loco, para que fosse feita a escolha dos melhores primers.

Os fragmentos de DNA obtidos foi para 78 primers nos 3 indivíduos, foram analisados pela técnica de eletroforese em gel de agarose 1,5% submersos no tampão TBE (Tris Borato EDTA – 1X) e, em seguida, corados com brometo de etídio, visualizados com o auxílio de um transiluminador de luz ultravioleta e fotografados para as análises posteriores. Os primers selecionados foram utilizados para a amplificação do DNA dos 75indivíduos das cinco populações. Em seguida foram avaliadas divergências genéticas entre as populações.

RESUTADOS

Caracterização da variabilidade dentro e entre populações

As cinco populações de Bothrops moojeni apresentaram uma baixa variabilidade genética, observada para os 5 primers de RAPD utilizados nos 75 indivíduos analisados. Considerando cada primer, o número de locos variou entre 9 e 18, com um total de 59 locos nas cinco populações.

A diversidade genética ou heterozigose esperada (Nei, 1973), quando se considera todos os locos simultaneamente nos 75 indivíduos variou entre 0 e 0,5, mostrando que existem locos com muita diversidade e locos que já não a possuem, indicando haver um processo de perda de diversidade genética. Quando esta diversidade genética é analisada por população observou-se uma variação entre 0,11 e 0,17, com um valor global de 0,199. Como o valor máximo esperado da diversidade genética quando se analisa um loco com dois alelos (pressuposto do RAPD) é 0,5, pode-se concluir que de maneira global a diversidade em B. moojeni está baixa, pois 0,199 não equivale nem à metade do valor esperado.

A análise de variância molecular (AMOVA) quando realizada considerando todos os locos mostrou que, de fato, existe uma estruturação na variabilidade genética destas populações, com um ST Φ igual a 0,1369, significativo ao nível de 1% através de 10000 permutações aleatórias. Da diversidade genética total, cerca de 13% da variabilidade genética está “entre” as populações, enquanto que 86% da variação encontra-se “dentro” das populações8), o que poderia indicar que já está ocorrendo uma redução na taxa de fluxo gênico entre as populações.

O processo de fragmentação proporciona a formação de “ilhas” de remanescentes que levam as populações à evoluir independentemente umas das outras, produzindo, desta forma, heterogeneidade espacial da variabilidade genética (alta estruturação) e ausência de padrão espacial na variabilidade genética (Sokal, 1986), como o que foi encontrado nestas populações de B. moojeni neste estudo. Em B. moojeni, não foram encontrados estudos abordando a presença de anomalias em populações selvagens.

Divergência e padrão espacial da variabilidade genética

As distâncias genéticas quando agrupados pelo UPGMA mostraram uma correlação cofenética do agrupamento relativamente baixa (0,59), de modo que as ligações do dendrograma não refletem corretamente os padrões multivariados de distância genética. Essa correlação cofenética baixa é esperada para sistemas que não apresentam uma estruturação hierárquica muito clara (Rodrigues & Diniz-Filho, 1998).

Implicações e sugestões para a conservação da espécie Bothrops moojeni

Os resultados do presente trabalho demonstram que a diversidade genética dessas populações é baixa para uma espécie que é considerada abundante na região do Cerrado, denotando a importância de estratégias de manejo e conservação para B. moojeni.

CONCLUSÕES

• Com base em uma avaliação do padrão de bandas foram selecionados 14 primers RAPD (OPA-01, OPA-03, OPB-04, OPB-06, OPB-18, OPM-01, OPP-04, OPP-06, OPP-07, OPP-08, OPP-13, OPP-14, OPP-15, OPP-16);
• As populações de Bothrops moojeni apresentam baixos níveis de diversidade genética para os cinco primers locos RAPD avaliados (OPB-18, OPP-04, OPP-06, OPP-15, OPP-16);
• A variabilidade genética se encontra significativamente estruturada entre e dentro das cinco populações de Bothrops moojeni avaliadas;
• Não foi encontrado um padrão espacial significativo da variabilidade genética nas populações de Bothrops moojeni para estes locos RAPD;
• A grande maioria dos artigos publicados no sítio “Institute for Scientific Information” (ISI) utilizando a espécie Bothrops moojeni se concentram nas áreas de Bioquímica & Biologia Molecular, Toxicologia e Farmacologia & Farmácia, não existindo nenhum trabalho publicado, até a presente data, que avalie a variabilidade genética desta espécie;
• Pode-se verificar que existe uma ampla possibilidade de utilização do veneno de B. moojeni, não só na soroterapia mais também para o desenho de novos fármacos de aplicação na saúde, tais como antitumorais, antimicrobianos e antiparasitários;
• Deve-se proceder com certa urgência a uma análise mais sistemática e de maior magnitude para avaliar a variabilidade genética desta espécie que além de sua importância para a conservação é uma espécie de muito interesse para a área de saúde.

REFERÊNCIA BIBIOGRÁFICA

LOPES DUTRA NICOLE CRISTINA - Caracterização da variabilidade genética em populações da serpente Bothrops moojeni. Hoge, 1966 (Squamata: Viperidae): importância para a conservação e utilização na saúde.